การเปรียบเทียบระดับการแสดงออกของยีน CYP3A4 ในเซลล์มะเร็งตับและเซลล์คล้ายเซลล์ตับ เมื่อบ่มเซลล์ในอาหารที่มียา Rifampicin |
| โดย: นางสาวเบญจพร ปรีชานุกูล, นางสาวศุภสิริ เลิศวิชา ปีการศึกษา: 2557 กลุ่มที่: 46 อาจารย์ที่ปรึกษา: คณิสส์ เสงี่ยมสุนทร , มนตรี ยะสาวงษ์ ภาควิชา: ภาควิชาชีวเคมี Keyword: HepaRG, Hepatocyte like cell, PCR, CYP3A4, HepaRG, Hepatocyte like cell, PCR, CYP3A4 |
| บทคัดย่อ: การเปรียบเทียบการแสดงออกของยีนไซโตโครมพี 450 ในเซลล์เพาะเลี้ยง 2 ชนิด คือเซลล์ คล้ายเซลล์ตับที่พัฒนามาจากเซลล์ต้นกำเนิดเนื้อเยื่อชั้น กลาง (hepatocyte-like cell, HLC) และ เซลล์มะเร็งตับ (HepaRG) ในสภาวะก่อนและหลังการบ่มเซลล์กับยา rifampicin ที่ระดับความ เข้มข้น 0 และ 20 μM ระยะเวลา 48 ชั่วโมง การศึกษารูปร่างของเซลล์ (morphology) เพื่อยืนยัน ถึงความเข้มข้นของยาและสภาวะที่เหมาะสมสำหรับใช้เลี้ยงเซลล์ จากนั้น เปรียบเทียบระดับ mRNA ของไซโตโครมพี 450 โดยวิธีการสกัดแยก mRNA นำมาสังเคราะห์เป็น cDNA และเพิ่ม จำนวน cDNA ด้วยเทคนิค real-time PCR ซึ่งจะได้ค่าของจำนวนรอบของการทำ PCR น้อยที่ สุดแต่ได้ประสิทธิภาพสูงสุด (threshold cycle, Ct) จากนั้น คำนวณหาระดับการเปลี่ยนแปลงการ แสดงออกของยีน (fold change) ด้วยวิธีการ 2- ΔΔCt โดยใช้ glyceroldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) เป็นยีนควบคุมเปรียบเทียบ ผลการศึกษาการแสดงออกของยีนไซโต โครมพี 450 ทั้ง 4 isotypes ได้แก่ CYP3A4, CYP2D6, CYP2E1 และ CYP2C9 พบว่าการ แสดงออกของยีน CYP3A4, CYP2D6, CYP2E1 และ CYP2C9 ในเซลล์ HLC เพิ่มขึ้น 2.90, 0.48, 0.33 และ 0.18 เท่าตามลำดับ ส่วน HepaRG เพิ่มขึ้น 2.90, 0.51, 0.24 และ 0.09 เท่า ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบระดับของ mRNA ในเซลล์หลังจากบ่มร่วมกับยา rifampicin กับกลุ่มที่ ไม่ได้บ่มยาและการเพิ่มขึ้น ของระดับ mRNA ของ HLC มีความใกล้เคียงกับเซลล์ HepaRG ซึ่ง เป็นเซลล์ที่นิยมใช้ศึกษาเอนไซม์ CYP450 จากผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่าเซลล์คล้ายเซลล์ตับ ที่พัฒนามาจากเซลล์ต้นกำเนิด (HLC) สามารถใช้เป็นแบบจำลองที่ดีในการศึกษากระบวนการเม ตาบอลิซึมของยา นอกจากนั้น เซลล์ HLC ยังมีคุณสมบัติเป็นเซลล์ปกติจึงสามารถนำไปศึกษา กลไกการเกิดโรคที่เกี่ยวข้องกับตับแทนการใช้เซลล์มะเร็งตับได้ |
| abstract: The comparison of Cytochrome P450 genes expression in hepatocyte-like cell derived from mesenchymal stem cell and hepatocellular carcinoma cell line (HepaRG) after incubate with 0 or 20 μM rifampicin for 48 hours. The morphology of the cells was observed to confirm the optimal dose and culture condition. Total mRNA from hepatocyte cells was extracted and used as a template for cDNA synthesis. CYP450s expressions were detected by amplifying cDNA with specific primers using real-time PCR technique. Expression levels were calculated by threshold cycle (Ct) which represents minimum number of PCR cycle that giving the maximum PCR efficiency. The fold change of CYP450 (CYP3A4, CYP2D6, CYP2E1 and CYP2C9) was calculate from ΔΔCt method and normalized with that of endogenous GAPDH and the corresponding gene expression in HLCs and HepaRG cells. ΔΔCt was transformed into fold change using formula: fold change = 2- ΔΔCt. The expressions of CYP3A4, CYP2D6, CYP2E1 and CYP2C9 in HLCs were significantly increased to 2.90, 0.48, 0.33 and 0.18 folds respectively. In HepaRG, the expressions were increased to 2.90, 0.51, 0.24 and 0.09 folds respectively after the induction with rifampicin. The upregulation of CYP450 level in HLCs were similar to that HepaRG. These results suggest that hepatocyte-like cell derived from human mesenchymal stem cell provide a valuable model for human drug metabolism studies. Moreover, HLCs also have normal karyotype that can serve as a remarkable tools for liver disease development which suitable than hepatocellular carcinoma cell line. |
| . |