การตรวจเชื้อ Staphylococcus aureus อย่างรวดเร็ว โดยเทคนิค LAMP

โดย: วศินี อุดมกิจมงคล, ศรีทอง สีขาว    ปีการศึกษา: 2554    กลุ่มที่: 3

อาจารย์ที่ปรึกษา: จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์    ภาควิชา: ภาควิชาจุลชีววิทยา

คำค้นหา: Staphylococcus aureus., Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), ยีน triphosphate isomerase, polymerase chain reaction, Staphylococcus spp., Loop-mediated isothermal amplification, LAMP, Triosephosphate isomerase gene, polymerase chain reaction
บทคัดย่อ:
Staphylococcus aureus เป็นแบคทีเรียแกรมบวก รูปกลม ไม่สร้างสปอร์ พบปนเปื้อนในอาหาร ยา และเครื่องสำอาง ก่อให้เกิดโรคอาหารเป็นพิษ และโรคติดเชื้อที่ผิวหนัง และอาจลุกลามเข้าสู่กระแสเลือดได้ การศึกษานี้เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจสอบเชื้อ S. aureus อย่างรวดเร็วด้วยเทคนิค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) โดยการตรวจสอบยีน triosephosphate isomerase (Tpi59) ขนาด 402 bp ของเชื้อ S. aureus ซึ่งเป็นยีนที่มีความจำเพาะของเชื้อเป็นยีนเป้าหมาย LAMP หรือ Loop-mediated isothermal amplification เป็นเทคนิคใหม่ที่ใช้ในการตรวจวิเคราะห์ DNA ที่เพิ่มจำนวนในหลอดทดลอง โดยใช้เอนไซม์ BstI polymerase ทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิที่คงที่ อ่านผลได้อย่างรวดเร็ว การทดลองได้ออกแบบ primers ที่มีความจำเพาะต่อยีน Tpi59 ของเชื้อ S. aureus จำนวน 4 เส้น โดยใช้โปรแกรม PrimerExplorer V4 แล้วนำ primers ไปทดสอบความจำเพาะต่อ genomic DNA ของ S. aureus โดยเทคนิค LAMP ที่สภาวะต่างๆ ซึ่งสรุปได้ว่า สภาวะที่เหมาะสม คือ อุณหภูมิ 62°C ระยะเวลา 60 นาที ความเข้มข้นของแมกนีเซียมซัลเฟต 100 mM ซึ่งให้ผลบวกกับเชื้อ S. aureus ATCC 6538, S. aureus 1334, S. aureus 1609, S. aureus DMST 1386 และ S. aureus ATCC 25923 และทดสอบยืนยันผลโดย การตัด LAMP product ด้วยเอนไซม์ Tru9 I ส่วนการตรวจสอบกับ genomic DNA ของแบคทีเรียอื่นๆ S. typhimurium ATCC 11331, E. coli ATCC 25922, B. cereus ATCC 14579 พบว่าให้ผลลบ การทดสอบความไวของการตรวจสอบเชื้อ S. aureus พบว่าความเข้มข้นของ DNA น้อยที่สุดที่ตรวจพบได้โดยเทคนิค LAMP คือ 3.2 pg DNA/μL มีความไวมากกว่าเทคนิค Polymerase Chain Reaction (PCR) ที่ต้องมีความเข้มข้นของ DNA น้อยที่สุดที่สามารถตรวจพบได้คือ 320 pg DNA/μL นอกจากนี้เทคนิค LAMP ไม่จำเป็นต้องใช้ agarose gel electrophoresis พิสูจน์ DNA เพราะเทคนิค LAMP อ่านผลได้ทันที โดยสังเกตจากตะกอน magnesium pyrophosphate ที่เพิ่มขึ้นจากกระบวนการ หรือการเปลี่ยนสีเมื่อเติมสี SYBR green I ดังนั้นเทคนิค LAMP จึงเป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพ รวดเร็ว และมีความจำเพาะเจาะจงในการตรวจสอบ S. aureus
abstract:
Staphylococcus aureus is a gram positive coccus, non-spore-forming bacterium which could be found in food, drugs and cosmetics. This bacterium can cause food poisoning diseases, skin infections and sepsis or bacteremia. Project’s objective is to develope rapid detection for S. aureus by LAMP technique by using 402 bp of triosephosphate isomerase gene (Tpi59) of S. aureus as specific gene target. LAMP or Loop-mediated isothermal amplification is a new technique to rapidly detect amplified DNA in vitro, using BstI polymerase with single temperature incubation. PrimerExplorer V4 program was used to design 4 primers to Tpi59 gene of S. aureus. The designed primers were used to study the optimal conditions of amplification reactions. The optimal conditions were 62°C for 60 minutes and 100 mM magnesium sulfate. The result demonstrated, the primers were specific to S. aureus ATCC 6538, S. aureus 1334, S. aureus 1609, S. aureus DMST 1386 and S. aureus ATCC 25923. The amplified LAMP products were confirmed by Tru9 I digestion. Non-S. aureus group; E. coli ATCC 25922, S. typhimurium ATCC 11331, B. cereus ATCC 14579 gave negative results. The sensitivity of LAMP technique was studied, LAMP could be detected the minimal DNA concentration at 3.2 pg DNA/μL which is more sensitive than Polymerase Chain Reaction (PCR) technique which could be detected DNA at 320 pg DNA/μL. In addition to the sensitivity LAMP also need only 60 minutes to increase the copy number of target gene while PCR need 90 minutes. LAMP could be detected by tubidity caused by increasing quantity of magnesium pyrophosphate in solution or with addition of SYBR green I, a color change can be seen. So agarose gel electrophoresis is no need for visualized amplification products. LAMP is an effectively, rapidly, and specific detected S. aureus.